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溶菌酶的性質及制備方(fang)法有(you)哪(na)些？
溶菌酶(mei)（lysozyme）又稱胞壁(bi)質酶（muramidase）或N-乙酰(xian)胞(bao)壁質聚糖(tang)水(shui)解酶(mei)（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解細菌(jun)中(zhong)黏多糖的(de)(de)堿性酶(mei)(mei)。溶菌(jun)酶(mei)(mei)主要通(tong)過(guo)破壞細胞(bao)壁中(zhong)的(de)(de)N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基(ji)葡萄糖之間的β-1,4糖(tang)苷鍵(jian)，使細胞壁(bi)不溶性黏多糖(tang)分解(jie)成可溶性糖(tang)肽，導致細胞壁(bi)破裂內容物逸出而(er)使細菌溶解(jie)。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白(bai)直接結合，與DNA、RNA、脫(tuo)輔基蛋白(bai)形成復(fu)合(he)體，使病毒(du)失(shi)活。 該(gai)酶(mei)廣泛存在于人體多種組織中，鳥類(lei)和(he)家禽的蛋(dan)清(qing)、哺(bu)乳動物的淚、唾液(ye)、血漿(jiang)、乳汁等(deng)液(ye)體，以及微生物也含(han)此酶(mei)，其中以蛋(dan)清(qing)含(han)量最(zui)為豐富。 其(qi)中根據其(qi)來源的(de)不同，可(ke)以(yi)(yi)將(jiang)其(qi)分(fen)為(wei)四類，分(fen)別是植物溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)(mei)、動物溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)(mei)、微生物溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)(mei)以(yi)(yi)及蛋清(qing)溶(rong)(rong)菌(jun)酶(mei)(mei)。
性質：
1、溶(rong)菌酶純品呈白色(se)、微(wei)(wei)黃或黃色(se)的(de)結晶體(ti)或無(wu)定形粉(fen)末，無(wu)異味，微(wei)(wei)甜，易溶(rong)于水，不溶(rong)于丙酮。溶菌酶遇堿易被破壞，但在酸性環境下，溶菌酶對熱的穩定性很強，在pH值為4-7時，100℃處理1min，仍能較好地保持活力(li):pH值為3時(shi)，能耐100℃加(jia)熱處理(li)45min。
2、溶(rong)菌(jun)酶(mei)化學性質非常(chang)穩(wen)定，當pH值在(zai)一定范圍內(nei)劇烈變(bian)(bian)化時，其結構幾乎不變(bian)(bian)。溶菌酶不可(ke)逆變(bian)(bian)性(xing)的臨界點是(shi)77℃，隨溶劑(ji)的變(bian)(bian)化，不可逆變(bian)(bian)性臨界點也發生(sheng)變(bian)(bian)化，當溶菌酶(mei)所(suo)處溶液(ye)pH值小于1時，不可逆變性(xing)臨(lin)界點降低到43℃。
3、溶菌酶最適pH為5.3~6.4，可用于低酸性食(shi)品防腐； 溶(rong)菌酶(mei)作為防腐劑安(an)全(quan)性高(gao)，可被冷(leng)凍或干燥(zao)處(chu)理，且活(huo)力(li)穩定。
4、溶菌酶對幾種變性劑的敏(min)感程(cheng)度為:二惡烷>二(er)甲基乙酰胺>二甲基甲酰胺>丙酮，并(bing)且隨溶劑用量(liang)的增加而直線下降(jiang)。
制備方法：
目前溶菌(jun)酶可以(yi)以(yi)雞蛋(dan)清和蛋(dan)殼膜(mo)為(wei)材(cai)料提取制(zhi)得，常用的方法有親和層析法、離子交換樹脂法、直接結晶法和聚丙(bing)烯(xi)酸(suan)沉淀法等。
1、親(qin)和(he)層析法
親和(he)層析法是利用蛋白(bai)質(zhi)和(he)酶(mei)的(de)生物(wu)(wu)學特異性，即蛋白(bai)質(zhi)或酶(mei)與其(qi)配體(ti)之(zhi)間所(suo)具有的(de)專一性親和(he)力而設計的(de)色(se)譜(pu)技術。酶(mei)一底物(wu)(wu)復合(he)物(wu)(wu)形(xing)成之(zhi)后(hou)，在一定的(de)條件下(xia)分(fen)離復合(he)物(wu)(wu)便得到純凈的(de)酶(mei)。常常使用的(de)吸(xi)附劑為幾丁(ding)質(zhi)及其(qi)衍生物(wu)(wu)，如(ru)：幾丁(ding)質(zhi)粉、羧(suo)甲基幾丁(ding)質(zhi)、幾丁(ding)質(zhi)包埋(mai)纖維素、脫氨幾丁(ding)質(zhi)粉、N-酰化(hua)殼聚糖、脫氨再生幾丁質凝膠。
2、離子交換樹脂法
離子(zi)交換法是利(li)用離子(zi)交換劑與溶液中(zhong)的離子(zi)之(zhi)間所生的交換反應(ying)來進行分(fen)離的，分(fen)離的效果較好(hao)，廣(guang)泛(fan)用于微量組(zu)分(fen)的富集。一般流(liu)程為：鮮(xian)蛋一預(yu)處理一攪拌(ban)吸附一上柱洗脫一等電點沉淀一透析一噴霧干燥一成品(pin)。
溶菌酶在等電(dian)點以下較廣泛(fan)的(de)pH值范圍(wei)內，分子帶正電荷，可吸附于弱酸性陽(yang)離子交(jiao)換樹脂上，洗脫(tuo)后鹽析，可得(de)(de)溶菌酶沉淀，再進行精制可得(de)(de)成(cheng)品。蛋清吸附724樹脂(zhi)，洗(xi)滌緩沖液(ye)洗(xi)脫，硫酸(suan)銨溶液(ye)鹽(yan)析透析，用NaOH去堿性(xing)蛋白，凍干溶菌酶(mei)，凍干粉沉淀干燥得(de)到溶菌酶(mei)。在5—10℃下，將新鮮蛋清540kg加入(ru)到已處理好的80kg 724樹脂(zhi)中，攪拌吸附6h，在0—5℃靜置過(guo)夜(ye)。傾出上層蛋清，樹(shu)脂(zhi)離心甩干(gan)，用蒸餾水反(fan)復洗去黏(nian)附(fu)的卵蛋白(bai)，然后將樹(shu)脂(zhi)裝(zhuang)入柱(zhu)內，用0.15mol/L、pH=6.5磷(lin)酸(suan)緩沖溶液約(yue)150L洗滌樹脂，再(zai)用約600L的10%硫(liu)酸銨(an)溶液(ye)洗脫，收集洗脫液(ye)。洗脫液(ye)中加硫(liu)酸銨(an)，使最(zui)終含硫(liu)酸銨(an)量(liang)為40%，有白(bai)色沉淀生成(cheng)，冷處放置過夜。虹(hong)吸(xi)上(shang)層(ceng)清液，沉淀吸(xi)濾抽干，再用1倍蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解沉淀(dian)呈稀糊(hu)狀，然后裝入透析袋，在約5℃的條件下，對(dui)蒸餾(liu)水(shui)透(tou)析(xi)24h左(zuo)右，中間換水(shui)2—3次(ci)。離心去除(chu)沉淀，沉淀再(zai)(zai)用少(shao)量水洗一次(ci)，洗液與(yu)離心液合并。再(zai)(zai)往透(tou)析(xi)清(qing)液中慢慢加入1mol/L氫氧化na溶液，同時不斷攪拌，使pH值上升到8.0—9.0，如(ru)有白色沉淀，即(ji)離心除去。然后用3mol/L鹽酸調pH=5.0，冷凍干燥，即(ji)得(de)白色(se)片狀溶(rong)菌酶。也(ye)可將離心(xin)液(ye)用3mol/L鹽酸調pH=3.5，在攪拌下緩慢加入5%的固體氯化鈉，在約(yue)5℃的溫(wen)度下靜置48h，離心，沉淀用0℃丙酮(tong)洗滌，干燥，即得溶菌酶。
3、食鹽直接結晶法
在蛋清中加入一(yi)定(ding)量的碘化物或碳酸鹽(yan)等鹽(yan)類，并(bing)調(diao)pH值至(zhi)9.5—10.0，溶菌(jun)酶(mei)會以(yi)結(jie)晶形式慢慢析(xi)出，而大多數(shu)蛋白質仍然(ran)在溶液。在超濾濃縮脫鹽后，為獲(huo)得較純產品，采用(yong)結(jie)晶純化酶(mei)液經超濾處理后，用(yong)NaOH調整pH 9.5，離心(xin)去除。上(shang)清液在緩緩攪拌下(xia)，加(jia)NaCl至5%，靜置(zhi)一(yi)周，得(de)粗結晶。結晶溶(rong)于(yu)pH 4.6醋酸(suan)水(shui)中，分去不溶物后，進行重(zhong)結晶，結晶的(de)最終得(de)率(lv)為60%左右。即每公斤蛋清中可得(de)重(zhong)結晶品(pin)近1.3 g，活(huo)力(li)測(ce)定為8000U/mg。
4、聚丙烯酸沉淀法
聚丙烯酸(suan)沉淀法為將(jiang)提取過濾后含酶洗脫(tuo)液，首先經過吸附步驟，即將(jiang)過濾后的澄清(qing)溶液用(yong)20%的NaOH溶液(ye)調pH至6.0，在調pH值的過程中不停的攪(jiao)拌(ban)。有少(shao)量的乳(ru)白(bai)色沉淀析出(chu)，然(ran)后加入(ru)15%聚丙烯酸，立(li)即有(you)白色沉淀(dian)析出，加(jia)至pH值(zhi)為3.0為(wei)止(zhi)，靜置(zhi)17個(ge)小時進行靜析，得到粘附于底(di)部(bu)的乳白色(se)膠狀物(wu)。第(di)二步解離，將(jiang)前(qian)步得到的溶菌酶聚丙烯酸(suan)凝聚物(wu)。加入少量蒸餾水(shui)并用(yong)0.5 mol/L的碳酸(suan)鈉(na)，將(jiang)其溶解，轉移后，將(jiang)pH值調到9.5。加入5%CaCl2溶(rong)液將溶(rong)菌酶聚丙烯酸解離，至無沉淀析(xi)出，然后過濾，得到澄清(qing)溶(rong)液。第三(san)步鹽析(xi)，將所得澄清(qing)溶(rong)液加入5%的(de)NaCI溶液攪拌(ban)均勻。放入冰箱(xiang)調溫度(du)為0℃。待有晶體析(xi)出(chu)后，用(yong)無水乙醇洗滌數次，置恒(heng)溫培(pei)養箱中40℃條件下干(gan)燥稱重。
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