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Q1.引物是如何合成的？

目前引物合成(cheng)基本采(cai)(cai)用(yong)固相(xiang)亞磷酰胺(an)三酯法。DNA合成(cheng)儀有很多種,無論采(cai)(cai)用(yong)什么機器合成(cheng)，合成(cheng)的(de)原理都相(xiang)同，主要差別在于合成(cheng)產率的(de)高低，試劑消耗(hao)量的(de)不同和單個循環用(yong)時(shi)的(de)多少。

（1）    去保(bao)護(hu)：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保(bao)護(hu)基團DMT，獲得游離的5'- OH；

（2）    耦(ou)合：同時加入活化(hua)劑(ji)和(he)新的(de)堿基，新的(de)堿基5'-OH仍然被(bei)DMT保護，3'端被(bei)活化(hua)與溶液中游離的(de)5'-OH發生耦(ou)合反應；

（3）    封閉：耦合(he)反應(ying)中極少數5'- OH沒有(you)參加反應(ying)，用封閉試劑終止其后繼續發生反應(ying)；

（4）    氧(yang)化：加入(ru)氧(yang)化劑(ji)使其由核(he)苷(gan)亞(ya)磷(lin)酸酯形成更穩定的核(he)苷(gan)磷(lin)酸酯。

Q2.引物合成如何處理？

切割與脫(tuo)保護基：將合成好的寡(gua)核苷酸(suan)鏈從支持物上(shang)化學切割下來。常(chang)用(yong)新鮮的濃氨水來裂(lie)解(jie)CPG與初始核苷之(zhi)間的酯(zhi)鍵。斷裂(lie)下來的寡(gua)核苷酸(suan)帶有自由的3’羥基。

純(chun)(chun)化(hua)(hua)：根據所(suo)合成寡核苷酸的組成和應用來(lai)選定(ding)純(chun)(chun)化(hua)(hua)的方法(fa)。常(chang)用的純(chun)(chun)化(hua)(hua)方法(fa)有(you)：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根(gen)據寡核苷酸在260nm處的紫(zi)外吸收來定量。

儲存：分裝抽干。

Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？

合(he)成(cheng)(cheng)的引物5’為羥基(ji)，沒(mei)有磷酸(suan)(suan)基(ji)團。如果需(xu)要您可以用(yong)多核苷(gan)酸(suan)(suan)激酶(mei)進(jin)行(xing)5’端(duan)磷酸(suan)(suan)化(hua)，或(huo)者要求我(wo)們合(he)成(cheng)(cheng)時直接在5’或(huo)3’端(duan)進(jin)行(xing)磷酸(suan)(suan)化(hua)，需(xu)要另外收費。

Q4.需要什么級別的引物？

根據實驗需要(yao)，確(que)定訂購引物的純度級別。

Q5.需要合成多少OD數？

根據實(shi)驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做(zuo)(zuo)500-1000次50ul標準(zhun)PCR反應(ying)。如(ru)果(guo)是做(zuo)(zuo)基(ji)因拼接(jie)或退火后做(zuo)(zuo)連接(jie)，1 OD就足夠了。

Q6.如何計算引物的濃度？

引(yin)(yin)物(wu)(wu)保存在高(gao)濃(nong)度的(de)狀(zhuang)況下比較穩定(ding)。一般情況下，我們建議將(jiang)引(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)濃(nong)度配制成100pmol/ul，稱為保存濃(nong)度，而引(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)工作濃(nong)度一般配制成10-50pmol/ul。加水的(de)體積（微升(sheng)）可(ke)(ke)直接參照合成報(bao)告單上推薦的(de)體積，也可(ke)(ke)按下列方式計算(suan)：

V （微升）= OD數x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以從合成報告單上獲得。注意：1 OD₂₆₀= 33 ug/ml。

溶解前您需要核對合成報(bao)告(gao)單和(he)引物標簽上(shang)的引物OD數(shu)是否一(yi)致。如果不一(yi)致，請(qing)和(he)我們(men)。我們(men)可以根(gen)據(ju)生產(chan)記錄查到實際產(chan)量是多少。

Q7.如何計算引物的Tm值？

引物設(she)計軟件都可以給出Tm，與(yu)引物長度、堿基組成及所使(shi)用緩(huan)沖夜的離子強度有關。

長度為(wei)25base以下的引(yin)物，Tm計算公式為(wei)：Tm = 4℃（G + C）+ 2℃（A + T）

對于更長(chang)的寡聚(ju)核苷酸(suan)，Tm計(ji)算公(gong)式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 （GC%） – 600/size^＊

＊公式中，Size =引物長度。

Q8.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

非修飾的(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)（MW）在隨引(yin)(yin)物(wu)提供的(de)(de)(de)報告(gao)單上可以找到。如果需要估計(ji)一個引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)按(an)每(mei)個堿基(ji)的(de)(de)(de)平均(jun)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)為324.5，引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)=堿基(ji)數 x堿基(ji)的(de)(de)(de)平均(jun)分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)，或按(an)下列(lie)公式(shi)計(ji)算MW= （NA * WA） + （NC * WC） + （NG * WG） + （NT * WT） +（Nmod * Wmod）＋（Nx * ）+（ NI* WI） +16* Ns–62.

NA, NG, NC, NT, NI分別為引物中(zhong)堿(jian)基A或(huo)(huo)(huo)(huo)G或(huo)(huo)(huo)(huo)C或(huo)(huo)(huo)(huo)T或(huo)(huo)(huo)(huo)I的數(shu)量(liang)，WA, WG ,WC, WT, WI分別為引物中(zhong)堿(jian)基A或(huo)(huo)(huo)(huo)G或(huo)(huo)(huo)(huo)C或(huo)(huo)(huo)(huo)T或(huo)(huo)(huo)(huo)I的分子(zi)量(liang)，Nmod，Wmod分別為修飾基團的數(shu)目和分子(zi)量(liang)。對于混(hun)合(he)(he)堿(jian)基的分子(zi)量(liang)為混(hun)合(he)(he)堿(jian)基的分子(zi)量(liang)總(zong)合(he)(he)除(chu)以混(hun)合(he)(he)數(shu)，例(li)如G+A混(hun)合(he)(he)的分子(zi)量(liang)為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫(liu)代數(shu)目，硫(liu)代每個位置增加分子(zi)量(liang)16。

常規堿基分子量

常規修飾基團分子量

Q9.如何溶解引物？

干燥后(hou)的(de)引物質地非常疏松，開蓋前(qian)瞬(shun)時離(li)心一下，或(huo)管(guan)垂直向上(shang)在桌面上(shang)敲敲，將(jiang)引物粉末收集到(dao)管(guan)底。根據計算出(chu)的(de)體積加入去離(li)子(zi)無(wu)菌水(shui)或(huo)TE（pH8.0）緩沖液，室溫放(fang)置幾分(fen)鐘，振蕩助溶，離(li)心將(jiang)溶液收集到(dao)管(guan)底。溶解引物用的(de)水(shui)一般不要用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，因為有些(xie)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)的(de)pH值比較低（pH4-5）,引物在這(zhe)種條件下不穩(wen)定。

Q10.如何保存引物？

引物合成后，經過一系列處理和純化(hua)步驟，旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

干 粉：運輸時常溫運輸，-20℃可以保存一年。

儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復凍融，-20℃可以保存半年。

工作液：常規使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應避免反復凍融。

修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。

Q11.引物定量不準是怎么回事兒？

我們偶(ou)爾(er)收到(dao)用戶投訴定量(liang)不準的報告，出現這種情(qing)況的可能性(xing)有(you)：

（1）定(ding)量(liang)錯(cuo)誤(wu)、分裝錯(cuo)誤(wu)、引物抽干或收樣過程中意外(wai)丟失。這種(zhong)可能性有，但是很少，因(yin)為作為專(zhuan)業(ye)的(de)(de)引物合成公司，我們(men)的(de)(de)生產人員都(dou)是經過嚴格的(de)(de)專(zhuan)業(ye)培訓，這種(zhong)錯(cuo)誤(wu)是要求謹慎(shen)避(bi)免(mian)甚至杜絕(jue)的(de)(de)。一般情況下(xia)，引物都(dou)有留(liu)樣備份(fen)，接到用戶(hu)投(tou)訴后，我們(men)都(dou)會(hui)找出留(liu)樣重新(xin)定(ding)量(liang)，一般都(dou)沒有問(wen)題，如確實存在問(wen)題，則(ze)可安排重新(xin)準備一份(fen)。

（2）系統誤差(cha)(cha)，我們認為10%左右為允(yun)許(xu)誤差(cha)(cha)。使用過程中，引(yin)物(wu)工作濃度范(fan)圍很(hen)寬(kuan)，定(ding)量上(shang)的少許(xu)偏差(cha)(cha)不影(ying)響(xiang)實驗。

（3）用戶(hu)收到(dao)引物(wu)(wu)(wu)干粉時，打開引物(wu)(wu)(wu)管(guan)蓋前沒有離心或其他誤操作導(dao)致(zhi)引物(wu)(wu)(wu)干粉部分丟失。

（4）用(yong)戶(hu)沒有(you)能夠(gou)正(zheng)確(que)理解引物OD數(shu)的含義，沒有(you)能夠(gou)正(zheng)確(que)使用(yong)分(fen)光光度計，特別是使用(yong)微量測(ce)定；用(yong)戶(hu)沒有(you)將OD讀數(shu)，正(zheng)確(que)地轉換成(cheng)母液中OD數(shu)。這種情況比較常見。

  例(li)如(ru)，驗證(zheng)標2OD引物量是(shi)否準確，簡單的(de)(de)做(zuo)法是(shi)：加(jia)(jia)入(ru)1ml水(shui)，*溶解混勻后(hou)，取100ul,加(jia)(jia)入(ru)900ul水(shui)，用光徑(jing)為(wei)1cm的(de)(de)石(shi)英比色杯，波(bo)長260nm,此時光吸(xi)收的(de)(de)讀數為(wei)0.2。

Q12.zui長可以合成多長的引物？

我們合成過100base的(de)引物(wu)，但是產(chan)率很(hen)(hen)低(di)。除非需要，建(jian)議合成片段(duan)長(chang)度不要超過80base。引物(wu)越長(chang)，出(chu)現問題的(de)概率就越大(da)，按照目前的(de)引物(wu)合成效率，大(da)于80base的(de)粗產(chan)品，全長(chang)引物(wu)的(de)百(bai)分比不高，后(hou)續處(chu)理還(huan)有丟失很(hen)(hen)多，zui后(hou)的(de)產(chan)量(liang)很(hen)(hen)低(di)。

Q13.為什么修飾引物的產量要比一般引物低，價格要高?

主要因為是修飾單體穩定(ding)性較差，偶連時間長，效率低(di)，zui后得(de)到的產(chan)量(liang)自然低(di)于一般的引(yin)物。修飾引(yin)物通常需(xu)要PAGE或(huo)HPLC純化(hua)，純化(hua)過(guo)程損失大。修飾引(yin)物使用的原料是一般引(yin)物原料的幾百倍，所以(yi)產(chan)品的價格(ge)也(ye)高(gao)。

Q14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應(ying)需要引(yin)物(wu)的(de)5’磷(lin)酸(suan)基團。如(ru)果需要將合成的(de)引(yin)物(wu)退火(huo)直(zhi)接連接相(xiang)應(ying)的(de)載體(ti)上，引(yin)物(wu)需要磷(lin)酸(suan)化(hua)。磷(lin)酸(suan)化(hua)的(de)產物(wu)如(ru)果還不能連接載體(ti)上，需要檢查載體(ti)的(de)酶切效果，需要改善引(yin)物(wu)退火(huo)的(de)條件。SiRNA分子具有特(te)殊的(de)對稱(cheng)結(jie)構，退火(huo)的(de)難度(du)(du)較(jiao)大，退火(huo)時需要提(ti)高(gao)退火(huo)溫度(du)(du)。

Q15.如果測序發現引物突變，是否有補償？該如何處理？

如(ru)果出(chu)現測序(xu)發現引物位置堿(jian)基錯誤的情況，我(wo)們可以免費(fei)重合(he)一次，沒有其(qi)(qi)他(ta)任何補償(chang)(chang)或(huo)賠(pei)償(chang)(chang)，不承擔其(qi)(qi)他(ta)連帶責任，這是行規。原因我(wo)們在前(qian)面(mian)已提(ti)到(dao)，化學合(he)成效率(lv)不可能達到(dao)100%。

如果(guo)遇到(dao)這種情況(kuang)，首(shou)先和(he)我們，我們會檢(jian)查合(he)(he)成(cheng)(cheng)序列是否(fou)和(he)原(yuan)始訂單一(yi)(yi)致，如果(guo)確認(ren)引(yin)物(wu)(wu)合(he)(he)成(cheng)(cheng)序列沒(mei)有(you)(you)輸(shu)錯，我們建議(yi)重(zhong)新挑(tiao)取克隆(long)測(ce)序，您(nin)(nin)可能(neng)會找到(dao)正確克隆(long)的。根據我們經驗(yan)，40個堿基以(yi)(yi)下的引(yin)物(wu)(wu)，測(ce)1-2個克隆(long)就(jiu)可以(yi)(yi)了；40個以(yi)(yi)上的特別是用于全片(pian)段拼接(jie)合(he)(he)成(cheng)(cheng)的，就(jiu)需要多測(ce)一(yi)(yi)些(xie)了。一(yi)(yi)般情況(kuang)下，每(mei)個克隆(long)突(tu)變的位點都(dou)不(bu)一(yi)(yi)樣(yang)，正確的總是有(you)(you)的，就(jiu)是如何找到(dao)它。您(nin)(nin)也(ye)可以(yi)(yi)要求我們將引(yin)物(wu)(wu)免費重(zhong)合(he)(he)一(yi)(yi)次，不(bu)過重(zhong)合(he)(he)的引(yin)物(wu)(wu)和(he)*次的引(yin)物(wu)(wu)一(yi)(yi)樣(yang)，都(dou)可能(neng)含突(tu)變，不(bu)會因(yin)為(wei)重(zhong)合(he)(he)的引(yin)物(wu)(wu)就(jiu)減少您(nin)(nin)的遇到(dao)問題的幾(ji)率。基因(yin)拼接(jie)過程中，如果(guo)發現(xian)一(yi)(yi)段區域突(tu)變點不(bu)多，就(jiu)多測(ce)幾(ji)個，否(fou)則就(jiu)重(zhong)合(he)(he)一(yi)(yi)下引(yin)物(wu)(wu)。

根(gen)據全基(ji)因合成(cheng)的(de)數(shu)據，我們的(de)引物能(neng)做到(dao)2000個堿基(ji)的(de)片段，取三個克(ke)隆(long)，其中(zhong)至少(shao)有一個是正確的(de)。

Q17.為什么引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀小于1.5？

需要指出的是OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值不能用來衡量引物的純度。OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值過低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個20base同聚體引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，清楚表明OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值與引物的堿基組成密切相關。

Q18.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

通常(chang)可以用(yong)EB染色的(de)方(fang)法(fa)來判斷雙鏈DNA的(de)量(liang)（如(ru)質粒DNA），因(yin)為EB可以嵌(qian)合到(dao)雙鏈DNA中。而(er)合成(cheng)的(de)單(dan)鏈DNA，由(you)于堿(jian)基組(zu)成(cheng)不(bu)(bu)同(tong)，形成(cheng)二級結(jie)構的(de)可能性不(bu)(bu)同(tong)，EB的(de)染色程度也會有差異(yi)，比(bi)如(ru)Oligo（dT）等(deng)不(bu)(bu)形成(cheng)二級結(jie)構，EB染色效果就(jiu)非常(chang)差。所以不(bu)(bu)要用(yong)EB染色的(de)方(fang)法(fa)來定量(liang)，而(er)用(yong)紫外分光光度計檢測。

Q19.如何檢測引物的純度？

實驗室方便的(de)做法(fa)(fa)是用PAGE方法(fa)(fa)。使用加(jia)(jia)有7M尿素(su)的(de)16%的(de)聚丙烯酰胺凝(ning)膠進行(xing)電(dian)(dian)泳(yong)。取0.2-0.5OD的(de)引物(wu)，用尿素(su)飽(bao)和(he)液溶解(jie)或引物(wu)溶液中加(jia)(jia)入尿素(su)干(gan)粉直到飽(bao)和(he)，上樣(yang)(yang)前加(jia)(jia)熱變性（95℃,2mins）。加(jia)(jia)入尿素(su)的(de)目的(de)一(yi)是變性，二是增加(jia)(jia)樣(yang)(yang)品(pin)比重，容易加(jia)(jia)樣(yang)(yang)。600V電(dian)(dian)壓進行(xing)電(dian)(dian)泳(yong)，一(yi)定時間后(hou)（約2-3小時），剝膠，用熒(ying)光TLC板在紫外燈下檢測(ce)帶型，在主(zhu)帶之下沒有雜帶，說明(ming)純度是好的(de)。如果條件許可，也可以用銀染方式染色。

Q20.已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？

如果您溶解引(yin)物(wu)的(de)水pH過低(di)(di)或污染了菌或核酸酶，會使引(yin)物(wu)降解。使用時沒(mei)有(you)(you)充分解凍(dong)(dong)混(hun)合，液體不(bu)均(jun)勻也可能會造(zao)成引(yin)物(wu)加入量(liang)不(bu)準確。建(jian)議分裝引(yin)物(wu)，避免反復凍(dong)(dong)溶。建(jian)議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引(yin)物(wu)，因(yin)為有(you)(you)些蒸餾水的(de)pH值比較低(di)(di)（pH4-5）,引(yin)物(wu)在這種條(tiao)件下(xia)不(bu)穩定。還有(you)(you)一種可能性(xing)是引(yin)物(wu)沒(mei)有(you)(you)問題，而是PCR使用材料特別是模板的(de)質(zhi)量(liang)與先前使用的(de)不(bu)*一致。

Q21.引物是我們設計的，現在您擴不出來，我們要負責嗎？

不承(cheng)擔相關責(ze)任。我們為一些實驗經驗不足的(de)客戶(hu)，免費設計(ji)(ji)引(yin)(yin)物(wu)(wu)，提供一定的(de)便利。我們遵循一般的(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)設計(ji)(ji)原則(ze)設計(ji)(ji)好引(yin)(yin)物(wu)(wu)之(zhi)后(hou)都會發給您(nin)確認(ren)，而(er)后(hou)再安(an)排合成并(bing)保(bao)證引(yin)(yin)物(wu)(wu)質量。但是設計(ji)(ji)的(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)是否(fou)能夠滿足您(nin)的(de)實驗要求(qiu)，一定擴增出您(nin)需要的(de)基因片段(duan)，誰也不能100%保(bao)證。

Q22.PCR擴增無目的片段是引物質量有問題嗎？

PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)無目的(de)(de)(de)條帶或(huo)者非特異性擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)，影(ying)響因(yin)素(su)是(shi)多方(fang)面(mian)的(de)(de)(de)，需要耐(nai)心地分析(xi)，如(ru)(ru)模板結構與(yu)質(zhi)量(liang)、反應條件(jian)、引(yin)物設計等(deng)(deng)等(deng)(deng)。當(dang)今發展出各(ge)(ge)色各(ge)(ge)樣的(de)(de)(de)PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)技術，各(ge)(ge)色各(ge)(ge)樣的(de)(de)(de)高溫聚合酶，就是(shi)來解決PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)中遇到的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)不出，擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)效(xiao)率低的(de)(de)(de)問(wen)題。如(ru)(ru)巢式PCR就是(shi)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)拷貝數(shu)很低的(de)(de)(de)基因(yin)片段(duan)。通(tong)過提高模板質(zhi)量(liang)、優化反應條件(jian)等(deng)(deng)方(fang)面(mian)找到對策，或(huo)者有(you)必要時(shi)重(zhong)新設計引(yin)物，在實(shi)驗(yan)時(shi)設置對照來判(pan)定原因(yin)。如(ru)(ru)果您(nin)(nin)(nin)懷疑引(yin)物的(de)(de)(de)問(wen)題，請(qing)(qing)您(nin)(nin)(nin)首先測定您(nin)(nin)(nin)溶解的(de)(de)(de)引(yin)物的(de)(de)(de)OD值，看實(shi)驗(yan)時(shi)加(jia)入的(de)(de)(de)引(yin)物量(liang)是(shi)否正確。如(ru)(ru)果量(liang)是(shi)正常(chang)的(de)(de)(de)，請(qing)(qing)您(nin)(nin)(nin)告(gao)訴我司您(nin)(nin)(nin)的(de)(de)(de)引(yin)物編號，我們會復(fu)查(cha)留存樣品。如(ru)(ru)不明原因(yin)，我們免(mian)費為您(nin)(nin)(nin)重(zhong)新合成一(yi)次。如(ru)(ru)果仍(reng)然不能(neng)擴(kuo)(kuo)增(zeng)(zeng)，請(qing)(qing)您(nin)(nin)(nin)查(cha)找其(qi)它原因(yin)。多數(shu)情況下我們復(fu)檢引(yin)物質(zhi)量(liang)都沒有(you)問(wen)題，因(yin)為我們在引(yin)物出售前已經(jing)嚴(yan)格把好質(zhi)量(liang)關。

Q23.常用熒光染料參數

Q24.引物的質量是不是跟序列有關？

四種堿基的(de)(de)(de)(de)(de)性質(zhi)(zhi)和(he)各自保護基的(de)(de)(de)(de)(de)性質(zhi)(zhi)都有(you)(you)差別(bie)。所以(yi)合成難(nan)度是不一(yi)樣的(de)(de)(de)(de)(de)。難(nan)度zui大的(de)(de)(de)(de)(de)當屬GC重復(fu)多的(de)(de)(de)(de)(de)和(he)序列(lie)中還有(you)(you)多個連(lian)續(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)G的(de)(de)(de)(de)(de)引物(wu)。尤其對于后者，國內公司一(yi)般(ban)都做不了(le)20個G以(yi)上的(de)(de)(de)(de)(de)引物(wu)。實驗(yan)證明，如果引物(wu)中有(you)(you)超過三(san)個連(lian)續(xu)G的(de)(de)(de)(de)(de)結構，傳統方法得到的(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)物(wu)質(zhi)(zhi)量就會開始下降(jiang)。而且目前通用的(de)(de)(de)(de)(de)脫鹽、OPC和(he)PAGE方法都無效。

我們擁有(you)的HEPD技術能夠克服高(gao)GC或者高(gao)G含(han)量引物(wu)的合成和純(chun)化障礙，對普(pu)通引物(wu)、高(gao)GC引物(wu)和無論長短的oligo d（G）都能得到同樣(yang)的非常好的結果(guo)