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Western blotting實驗步(bu)驟
1．蛋(dan)白質的(de)樣品制(zhi)備：
取心肌(ji)(ji)組(zu)織(zhi)50mg，待組(zu)織(zhi)塊(kuai)自行溶解(jie)，用濾(lv)紙吸去其(qi)表面水分，將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)放入(ru)(ru)玻(bo)(bo)璃勻漿(jiang)器球(qiu)狀(zhuang)部位(wei)，用組(zu)織(zhi)剪盡(jin)量(liang)將(jiang)其(qi)剪碎，將(jiang)剪碎的心肌(ji)(ji)組(zu)織(zhi)放入(ru)(ru)玻(bo)(bo)璃勻漿(jiang)器的桿狀(zhuang)部，按(an)1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌(ji)(ji)組(zu)織(zhi)的比例加(jia)入(ru)(ru)RIPA和PMSF（先加(jia)RIPA再加(jia)PMSF），將(jiang)玻(bo)(bo)璃勻漿(jiang)器插入(ru)(ru)冰中，勻漿(jiang)約(yue)30分鐘。
將(jiang)心肌組(zu)織(zhi)勻漿轉移(yi)到離心管中，4℃12000g離心5分鐘，收集上清（如有粘稠物進一步用超聲處理），樣品分裝(zhuang)凍存于(yu)-20℃備用。
2 .測定蛋白濃(nong)度：
2.1 按50：1配置BCA工作液。
2.2 10ulC液（蛋(dan)白(bai)標(biao)準）+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋(dan)白(bai)標(biao)準液。
2.3 分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將(jiang)蛋白標準(zhun)液加(jia)入(ru)96孔(kong)板的(de)第1~8標準(zhun)孔(kong)中，在(zai)其他樣品孔(kong)中加(jia)入(ru)10ul待(dai)測樣品。
2.4 分別加PBS定容(rong)至20ul。
2.5 各(ge)孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時。
2.6 用酶標儀測(ce)(ce)定蛋白濃度：測(ce)(ce)定A562，依(yi)標準曲(qu)線算出蛋白濃度。
3 SDS-PAGE電泳：
3.1 制(zhi) 膠(jiao)(jiao): 按比例配制(zhi)分(fen)離膠(jiao)(jiao)，緩緩地搖(yao)動溶(rong)(rong)液，使(shi)激活劑混合均勻，將(jiang)凝膠(jiao)(jiao)溶(rong)(rong)液平緩地注(zhu)(zhu)入(ru)(ru)兩層玻璃極中(zhong)，再在(zai)液面上(shang)小心(xin)注(zhu)(zhu)入(ru)(ru)一(yi)層水，以(yi)阻止氧(yang)氣(qi)進(jin)入(ru)(ru)凝膠(jiao)(jiao)溶(rong)(rong)液中(zhong)，靜置40min。同前按比例配制(zhi)濃縮(suo)膠(jiao)(jiao)，但混勻溶(rong)(rong)液時不要過(guo)于劇烈以(yi)免引入(ru)(ru)過(guo)多地氧(yang)氣(qi)。吸去不連續系統中(zhong)下層分(fen)離膠(jiao)(jiao)上(shang)的(de)水分(fen)，連續平穩的(de)注(zhu)(zhu)入(ru)(ru)凝膠(jiao)(jiao)溶(rong)(rong)液，然后(hou)小心(xin)插入(ru)(ru)梳子并注(zhu)(zhu)意(yi)不得在(zai)齒尖留有氣(qi)泡，靜制(zhi)60min以(yi)上(shang)以(yi)保證(zheng)*聚合。
3.2 預電泳： 將聚合好的凝膠安置于(yu)電泳槽中，小心拔(ba)去(qu)梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。（目的是清(qing)除凝膠內的雜(za)質， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程(cheng)中電泳的暢(chang)通）。
3.3 樣品準(zhun)備：首先計算上(shang)(shang)樣體積，然后按(an)樣品：上(shang)(shang)樣buffer=4：1的比例加入上(shang)(shang)樣bufer混勻，沸(fei)水煮10分鐘，冰上(shang)(shang)5分鐘。
3.4 加 樣： 預電泳后依次加入標準(zhun)品（Marker）和待(dai)分析樣品。（加樣時間要盡(jin)量短(duan)，以(yi)免(mian)樣品擴散(san)，可在未加樣的(de)孔中加入等量的(de)樣品緩沖液避免(mian)邊緣效(xiao)應。每個泳道(dao)加5ul。
3.5 電(dian) 泳(yong)： 加樣完畢，選擇80V恒壓進行電(dian)泳(yong)，電(dian)泳(yong)直至(zhi)溴酚藍染料前沿(yan)到達(da)兩膠交(jiao)界處（一般約20分鐘），更換至(zhi)100V恒壓電(dian)泳(yong)，電(dian)泳(yong)直至(zhi)溴酚藍染料前沿(yan)下至(zhi)凝膠末端處，即(ji)停止(zhi)電(dian)泳(yong)（一般約為1小(xiao)時20分鐘）。
4．轉(zhuan) 膜：
4.1 切膠(jiao)：將電泳完畢的膠(jiao)完整的放(fang)在盛有(you)電轉液的玻璃皿中，將目的蛋白所在區(qu)域(yu)切下來，測量其長(chang)寬(kuan)，并記錄。
4.2 剪(jian)膜和濾紙(zhi)：按膠(jiao)的(de)尺寸剪(jian)膜和濾紙(zhi)（濾紙(zhi)長(chang)寬較(jiao)凝(ning)(ning)膠(jiao)小0.5~1mm，PVDF膜長(chang)寬較(jiao)凝(ning)(ning)膠(jiao)大0.5~1mm），濾紙(zhi)浸(jin)入(ru)盛有(you)(you)(you)(you)電轉液的(de)玻璃皿(min)(min)中10秒鐘，膜放入(ru)盛有(you)(you)(you)(you)10%甲(jia)醇的(de)玻璃皿(min)(min)中10秒鐘，然后將兩者都放入(ru)盛有(you)(you)(you)(you)去(qu)離子水的(de)玻璃皿(min)(min)中3分(fen)鐘，進一步放入(ru)盛有(you)(you)(you)(you)電轉液的(de)玻璃皿(min)(min)中3分(fen)鐘。
4.3 向電(dian)(dian)轉槽中倒(dao)入(ru)部分電(dian)(dian)轉液，將海(hai)綿(mian)浸入(ru)。按如下順序制作“三明治”（注意避免兩邊濾紙相互接(jie)觸，以免發生短路）。從正(zheng)(zheng)極(ji)(ji)到(dao)負極(ji)(ji)按如下順序排列：正(zheng)(zheng)極(ji)(ji)-海(hai)綿(mian)-雙(shuang)層(ceng)濾紙-PVDF膜-凝膠-雙(shuang)層(ceng)濾紙-海(hai)綿(mian)-負極(ji)(ji)。（其中不能留有氣泡）卡緊轉膜板(ban)，電(dian)(dian)轉槽中倒(dao)滿電(dian)(dian)轉液，將轉膜板(ban)浸入(ru)電(dian)(dian)轉槽中，注意正(zheng)(zheng)負極(ji)(ji)要正(zheng)(zheng)確。插上電(dian)(dian)源，設定恒流20mA轉膜，4℃冰(bing)箱中。
5、膜的封(feng)閉(bi): 用TBST液洗滌印跡膜10分(fen)鐘x2次(ci)。放入5%脫(tuo)脂奶粉封(feng)閉(bi)液內，搖(yao)床(chuang)震動，70轉(zhuan)/分(fen)鐘，室溫(wen)封(feng)閉(bi)1小時30分(fen)鐘。
6、一抗孵(fu)育：
6.1 配制(zhi)(zhi)一抗(kang)：按相應抗(kang)體(ti)的效價加入(ru)一抗(kang)稀釋液，一抗(kang)稀釋液按0.05% TBST（ml）：脫脂(zhi)奶(nai)粉（g）=20：1配制(zhi)(zhi)。
6.2一抗孵(fu)育：將(jiang)封閉后的膜放(fang)入(ru)雜(za)交袋(dai)中，加入(ru)一抗約1ml，室溫搖床（70轉/分鐘）孵(fu)育1小時30分鐘。
6.3 用TBST洗滌膜(mo)10分鐘x3次。
7、二抗(kang)孵(fu)育：
7.1 配制二(er)抗(kang)：按相應抗(kang)體的效(xiao)價(jia)加入二(er)抗(kang)稀釋液(ye)，二(er)抗(kang)稀釋液(ye)按0.05%TBST（ml）：脫(tuo)脂奶粉（g）=20：1配制。
7.2 二抗(kang)孵育(yu)(yu)：將一抗(kang)孵育(yu)(yu)后的膜放入二抗(kang)中，室溫搖床（70轉(zhuan)/分鐘）孵育(yu)(yu)1小時30分鐘。
7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。
8、ECL顯色
8.1 配制(zhi)ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制(zhi)。
8.2 按(an)膜(mo)(mo)：工(gong)作(zuo)液(ye)=10cm2：1ml的比例將ECL工(gong)作(zuo)液(ye)覆(fu)蓋(gai)到膜(mo)(mo)表面(mian)，放(fang)置1~2分(fen)鐘后在凝(ning)膠(jiao)成像(xiang)系統(tong)中觀(guan)察、拍照。
我們的(de)實驗(yan)過程如下：
電泳： SDS-PAGE; 預電泳 恒壓55 V 20 min，上(shang)樣25 ul, 恒壓55 V 40 min左右，當樣品(pin)至(zhi)分離(li)膠(jiao)面時(shi)，恒壓75 V，到考(kao)馬斯亮藍至(zhi)底部，停(ting)止(zhi)電泳。
轉印(yin)：制作(zuo)轉印(yin)三明治，150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min。中止轉印(yin),有條(tiao)件可以(yi)利用麗春紅檢(jian)測總蛋白轉印(yin)是(shi)否成(cheng)功。
封閉(bi)：將轉(zhuan)印(yin)膜取出，用(yong)去離子水清洗(xi)，TBST洗(xi)一次(ci)5 Min后，加入5%的(de)脫(tuo)脂牛奶(nai)封閉(bi)，于(yu)28度封閉(bi)2小時。(注意封閉(bi)液(ye)，一抗稀(xi)釋液(ye)，二抗稀(xi)釋液(ye)均含有(you)脫(tuo)脂牛奶(nai)，可以配成含0.01%硫柳汞的(de)溶(rong)液(ye)以免牛奶(nai)變質)
洗膜1次，10 min，
一抗孵(fu)育：一抗濃度1：100（2.5%牛奶抗體稀釋液），4度孵(fu)育隔天
洗膜4次(ci)，每次(ci)15 min
二抗(kang)孵(fu)育：二抗(kang)濃度1：3000（2.5%牛奶(nai)抗(kang)體稀釋液(ye)），28度孵(fu)育1.5-2 H
洗(xi)膜(mo)(mo)4次(ci)，每次(ci)15 min（建(jian)議洗(xi)膜(mo)(mo)完畢后，不(bu)要立刻顯色(se)，靜置或(huo)者輕搖(yao)1.5h-2h后再顯色(se)）
顯色(se)：注意顯色(se)時(shi)(shi)間的控(kong)制(zhi)和曝光時(shi)(shi)間的控(kong)制(zhi)
祝您工作順利，實(shi)驗順利！
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