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遷移實驗（cell migration assay）
實驗材料
（1）ThinCert插(cha)入式細胞培(pei)養器: 24-well, 8.0-μm pore membranes （Greiner662638）
（2）細胞培養相關試劑：無血(xue)清(qing)培養基(ji)，10％血(xue)清(qing)培養基(ji)，PBS，0.02％EDTA
（3）固定液：甲醇
（4）染色(se)液：Giemsa染液
（5）封片劑：中性樹膠
（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片
操作步驟
（1）所有細胞(bao)培養試(shi)劑(ji)和(he)ThinCert放在37℃溫育；
（2）待測細胞培養至對數生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌一次，
用(yong)無(wu)血清(qing)培養基懸(xuan)浮細胞，計數，調整濃度 為2×105 /ml；
（3）在(zai)下室（即(ji)24孔板底(di)部(bu)）加入600－800μl 含10％血清的培養基(ji)，上 室加入100－
150μl細胞(bao)懸液(ye)，繼續在孵箱培養24小時；
（4）用鑷子小(xiao)心取出(chu)ThinCert，吸干上(shang)室液體，移到(dao)預(yu)先加入約800μl甲醇的孔中，室溫(wen)固定(ding)30分鐘(zhong)；
（5）取出ThinCert，吸干(gan)上(shang)室固定液，移到預先(xian)加(jia)入約800μl Giemsa染液 的孔中，室溫(wen)染色(se)15－30分鐘；
（6）輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)用清水沖洗浸泡數次，取出ThinCert，吸去(qu)上室液體，用濕棉棒小 心(xin)擦(ca)去(qu)上室底(di)部膜表面上的細胞；
（7）用(yong)小鑷(nie)子小心揭下膜，底(di)面朝上晾干(gan)，移至(zhi)載玻(bo)片(pian)上用(yong)中性樹膠(jiao)封片(pian)；
（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數，統計結果。
注(zhu)意事項
（1）根(gen)據(ju)待測細胞體(ti)積大(da)小選擇合適孔徑的(de)ThinCert。常用的(de)為8.0-μm孔徑（如
AGS細(xi)胞），如果(guo)細(xi)胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；
（2）根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時間。常規24-well ThinCert接種細胞數約
為2≈5×104/well， 遷(qian)移時(shi) 間 12≈36小時(shi)；
（3）由于Greiner公(gong)司的(de)24-Transwell內含24個獨(du)立的(de)ThinCert，為了避(bi)免操作(zuo)污染，
每次(ci)實驗可預先(xian)另準備(bei)一塊24孔普通培養板（Greiner）；
（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培養24小時獲得 的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），
具(ju)體可查(cha) 閱相關(guan)文獻；
（5）細胞懸液(ye)加入膜中央(yang)，盡量保證液(ye)面水平；
（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細胞，
以免(mian)影響讀數。尤其是(shi) 膜周邊上可用細牙(ya)簽或(huo)小鑷子纏上濕棉花擦洗(xi)，但要小心避免(mian)將膜戳破；
（7）Chamber和(he)膜上都無法標(biao)記，操作時應小心避免(mian)混淆實(shi)驗組(zu)和(he)對照組(zu)；
（8）充分晾(liang)干，避免(mian)殘留水分導致鏡下聚(ju)焦不一致。
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