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 用(yong)于快速缺失內源性人蛋白的可選擇的一步PCR介導的降解因(yin)子(zi)整合方法

科羅拉多大(da)學(xue)醫學(xue)院科學(xue)家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley開發了一(yi)種(zhong)選擇性的基因盒(he)，它(ta)采(cai)用CRISPR/Cas9基因編輯器使內源性的人蛋白的C端標記(ji)大腸(chang)桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）降解因(yin)子。這(zhe)個基因(yin)盒可以利(li)用框內自我剪切2A多肽和(he)嘌呤霉素抗(kang)性(xing)基因方法(fa)進行(xing)率正確整(zheng)合。PCR擴增供體的(de)eDHFR基因盒片(pian)段(duan)(duan)，每個片(pian)段(duan)(duan)末端帶有(you)100bp同源片段，它們通過以向導(dao)RNA為目(mu)標的可以切割3’端(duan)開放(fang)性閱讀框(kuang)的雙鏈DNA同源定向(xiang)修復的方(fang)法被整合。據此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了(le)含有eDHFR降(jiang)解因子標簽的(de)三個內(nei)源性蛋白(bai)的(de)細(xi)胞。當從培養基中(zhong)去除抗生素甲氧芐氨嘧啶時，在2-4小時就缺失了90%以上每個(ge)帶有eDHFR標簽的內源性(xing)蛋白，這種(zhong)缺失可(ke)以通(tong)過再次加入甲(jia)氧芐氨嘧(mi)啶得到恢復。嘌呤(ling)霉(mei)素的選擇性(xing)可(ke)以利用100bp同(tong)源性(xing)片段率(lv)回收框內降解因(yin)子融合(he)體(ti)。該方(fang)法可以適用于生成全基(ji)因(yin)組(zu)范圍的突變細胞(bao)庫。

原文：

Ryan M. Sheridan and David L. Bentley, Selectable one-step PCR-mediated integration of a degron for rapid depletion of endogenous human protein, BioTechniques 60:69-74 (February 2016)